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Best practice

Analisi omiche su sangue e urine

Sangue

Separazione Plasma

Pazienti a digiuno.

  1. Effettuare il prelievo di sangue intero (generalmente 10 o 20 ml) da una vena periferica con provette contenenti K3 EDTA;
  2. centrifugare entro due ore dal prelievo, a3000 gper 10 min alla temperatura di4°C; 
  3. prelevare il plasma (surnatante) con pipette adeguate, facendo attenzione a non aspirare il pellet che si forma sul fondo della provetta e dividerlo in aliquote (per esempio: da 1.5 ml) in provette adatte alla crioconservazione (tale procedura è essenziale per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti);
  4. conservare tutte le provette, in scatole da congelamento, a-80°Cfino al loro utilizzo.

Separazione siero

Pazienti a digiuno dalla mezzanotte.

  1. Effettuare il prelievo di sangue intero da una vena periferica con provette senza anticoagulante (provette vuote per siero) rispettando gli standard di sterilità/asepsi;
  2. mantenere il prelievo a temperatura ambiente per un intervallo di tempo compreso tra 30 e 45 minuti per favorire la formazione del coagulo;
  3. centrifugare il sangue a 3000 rpm per 15 minuti a temperatura ambiente;
  4. Dividere il surnatante in aliquote (es. da 1 ml) in provette adatte alla crioconservazione (tale procedura è essenziale per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti);
  5. conservare tutte le aliquote, in scatole da congelamento,  a-80°Cfino al loro utilizzo.

Isolamento cellulare

A. Isolamento linfomonociti

Materiale necessario per la raccolta del campione e per la procedura di isolamento:

  • Provette contenenti per esempio eparina, citrato, EDTA (volume delle provette da definire in relazione agli esperimenti pianificati);
  • Soluzione di Ficoll-Hypaque;
  • Phosphate-Buffer Solution (PBS) 1X pH7.4/1mM EDTA senza Ca++ e Mg++ ;
  • Tubi per centrifuga con volume di 50 ml;
  • Colorante Trypan blue;
  • Medium di congelamento composto da: 90% siero fetale di bovino (FBS) + 10% dimetilsolfossido (DMSO);
  • Una serie di vials.

Procedimento:

  1. Effettuare il prelievo di sangue intero (generalmente 10 o 20 ml) da una vena periferica con provette contenenti litio-eparina rispettando gli standard di sterilità/asepsi;
  2. Se possibile, effettuare le procedure di isolamento in tempi brevi o conservare il campione per breve periodo di tempo a temperatura di circa 4 °Cprocedendo al suo mescolamento continuo (attraverso rulli);
  3. In laboratorio, diluire il sangue intero attraverso l’utilizzo di PBS 1X pH7.4 / 1mM EDTA senza Ca++ e Mg++ rispettando un rapporto di 1:2;
  4. Porre 10 ml di soluzione di Ficoll-hypaque in un tubo da centrifuga e stratificare su di questa 20 ml di sangue diluito utilizzando una pipetta pasteur;
  5. Centrifugare la suddetta soluzione a 460 gper 30 minuti a temperatura ambiente (questa manovra consentirà la formazione di anelli e l’individuazione di quello relativo ai LMP) (A);
  6. Raccogliere con un'altra pipetta Pasteur l'anello relativo ai LMP (per tale operazione si consiglia di porre la punta della pipetta al di sopra dell'anello) (B);
  7. Riporre l’anello dei LMP in nuovi tubi da 50 ml e procedere alla diluizione del contenuto con PBS 1X pH7.4/1mM EDTA fino al raggiungimento di un volume finale di 40 ml;
  8. Mescolare per inversione;
  9. Centrifugare a 250 gper 12 minuti alla temperatura di 4°C;
  10. Eliminare il surnatante e riunire i due pellet in un unico tubo da 50 ml e aggiungere PBS 1X pH7.4/ 1mM EDTA fino a un volume finale di 40 ml;
  11. Mescolare per inversione;
  12. Centrifugare a 175 gper 12 minuti alla temperatura di 4°C;
  13. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di PBS 1X pH7.4/1mM EDTA;
  14. Prelevare circa 1 ml di sospensione cellulare e procedere con la conta in trypan blue (v. Tabella 1);
  15. Centrifugare a110 gper 12 minuti alla temperatura di 4°C;
  16. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet nel medium di congelamento composto da: 90% siero fetale di bovino (FBS) + 10% dimetilsolfossido (DMSO);
  17. Conservare le cellule a -80°Covernight e poi trasferirle in azoto liquido. Si consiglia di conservare un quantitativo di cellule pari a 10 milioni/vial. Tale procedura renderà possibile l’utilizzo delle suddette cellule per esperimenti successivi (estrazione degli acidi nucleici, proteine, esperimenti con colture cellulari).

Dai LMP prelevati dal sangue intero è possibile effettuare successivamente l’isolamento delle sottopopolazioni linfocitarie (Th1, Th2 etc.) attraverso varie metodiche (per esempio metodiche di sorting immunomagnetico) e seguendo le procedure riportate dalle ditte produttrici dei kit di isolamento.

B. Isolamento Eritrociti

  1. Effettuare il prelievo di sangue intero da una vena periferica con provette contenenti ammonio eparina o EDTA rispettando gli standard di sterilità/asepsi;
  2. centrifugare il sangue a1000 gper 10 minuti a temperatura ambiente;
  3. eliminare il buffy coat e il plasma arricchito in piastrine;
  4. effettuare 2 lavaggi con Hanks' Balanced Salt Solution;
  5. risospendere le cellule in Hanks' Balanced Salt Solution;
  6. aliquotare le cellule in provette da 1,5 ml;
  7. conservare le cellule a-80°Cfino al loro utilizzo.

C. Isolamento delle Piastrine

Riferirsi ai vari protocolli presenti in letteratura individuando la procedura più idonea alla tipologia di esperimento da effettuare.

 

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release  1
pubblicata il  20 luglio 2012 
da Gianluigi Zaza
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